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1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器 普通试剂购买于国药集团，分析试剂购买于Sigma公司，细菌DNA提取试剂盒购买于北京天恩泽基因有限公司，引物由华大基因公司合成。 PCR仪，美国应用生物系统公司；电泳仪，北京六一仪器厂；紫外分光光度计，日本日立公司；台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发公司；恒温水浴锅和全温度摇瓶柜，江苏太仓市强乐实验设备有限公司。
1.2 土样以及培养基 土样采自江西赣州宁都某果园脐橙根际，采集后无菌袋封存，做好标记带回实验室，去除植物残根、石块等杂物，然后4 °C保存。 TSB富集培养基(g/L)：胰蛋白胨15.0，大豆蛋白胨5.0，氯化钠5.0。pH 7.2±0.2。 无机磷培养基的配制参照文献[6]。
1.3实验方法
1.3.1 菌种筛选 富集：250 mL三角瓶中加入50 mL富集培养基，同时加入玻璃珠，1×105 Pa高压蒸汽灭菌。称取5 g土样，在超净工作台中加入富集培养基中，然后30 °C、160 r/min培养24 h。 初筛：富集后取样稀释10−6、10−5、10−4、10−3、10−2倍，分别取每个稀释度的液体300 μL涂布于无机磷固体养基平板中，倒置于30 °C培养箱，培养3−4 d，观察透明圈。挑取有透明圈的菌落反复划线培养[7]。 复筛：将纯化培养后的菌株接种于含有磷酸三钙无机磷的液体培养基中，30 °C、160 r/min摇床培养6 d。取2.0 mL发酵液8 000 r/min离心10 min，上清液用磷钼蓝比色法测定可溶性磷含量[8]。 可溶性磷含量的测定方法，采用磷钼蓝分光光度法测定，原理是磷酸根与钼酸铵在酸性条件下能够生成磷钼酸铵，而对二苯酚和亚硫酸钠能够将磷钼酸铵还原成蓝色的钼蓝，用分光光度计在660nm处测定钼蓝的吸光度计算磷含量[8]。结果计算公式如下：X=m×10/4V。 式中：X为发酵液磷含量，mg/L；m为从标准曲线查得的稀释发酵液中的磷含量，mg/L；V为吸取的稀释后的发酵液的体积，mL。
1.3.2 菌种的鉴定 (1) 菌种的16S rRNA基因序列分析。利用细菌DNA提取试剂盒提取菌株的DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对菌株进行PCR扩增[9]。对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，基因序列由华大基因公司测序。将测序结果在NCBI上对比分析[10]。 (2) G7菌种的生理生化实验。根据《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中的方法对菌株进行生理生化鉴定。
1.4 G7对不同磷源的分解能力 将保存在甘油管中的G7菌株接种于液体TSB培养基中过夜培养，然后取1 mL分别接种于5种不同磷源(磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝、植酸钙、卵磷脂，添加量为0.5%)的无机磷液体培养基中，每个摇瓶100 mL，对照组为不接种培养基，每组实验3个平行。30 °C、100 r/min培养6 d，连续取样测发酵液中的菌体量、磷含量和pH值[13]。
1.5初始pH及碳氮源对G7解磷能力的影响
1.5.1 培养基初始pH值对G7解磷能力的影响 调节磷酸三钙无机磷源液体培养基的初始pH值分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，G7接种后于30 °C、100 r/min培养7 d，连续取样测定培养液中的菌体量、磷含量以及pH值[14]。以考察培养基初始pH值对菌株溶磷能力的影响。每组实验3个平行。
1.5.2碳氮源对G7解磷能力的影响 将G7分别接种于含有不同单一碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、半乳糖，添加量为1%)和不同单一氮源(硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾，添加量为0.05%)的磷酸三钙无机磷源液体培养基中[7,15]。30 °C、100 r/min培养6 d，测定发酵液中的菌体量、磷含量和pH值。每组实验3个平行。
1.6 对G7解磷机理的初步研究 1.6.1发酵液中有机酸的测定 精确称取各种有机酸标准品配制有机酸标样母液，使用流动相(0.005 mol/L的H2SO4溶液)配制100 mL标准品母液，使用时取母液进行梯度稀释即可。色谱柱采用Phenomenex Luna C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱温为30 °C，流动相采用0.005 mol/L的H2SO4溶液，流速0.5 mL/min，检测波长210 nm，进样量20 μL，信噪比设为3。流动相使用前将其用0.22 μm 孔径的滤膜进行过滤。 将G7接种磷酸三钙培养基，30 °C、100 r/min培养7 d，连续取样测定发酵液中有机酸的含量。取2.0 mL发酵液，在4 °C、6 000 r/min条件下离心15 min，吸取1.0 mL上清液，用流动相稀释定容到25 mL的容量瓶中，用0.22 μm滤膜过滤，然后液相色谱分析[16-17]。
1.6.2 发酵液中磷酸酯酶的酶活测定 将G7接种磷酸三钙培养基，30 °C、100 r/min培养7 d，连续取样测定发酵液中磷酸酯酶活性。取发酵好的培养液2.0 mL，在4 °C、6 000 r/min条件下离心15 min，取0.5 mL上清液于具塞比色管中，加入MUB缓冲液(酸性磷酸酯酶用pH 6.5缓冲液，碱性磷酸酯酶用pH 11.0缓冲液) 4.0 mL，再加入1.0 mL对硝基苯酚磷酸钠溶液，盖上盖子混匀置于37 °C水浴锅1 h，加入氯化钙溶液1.0 mL和氢氧化钠溶液4.0 mL混匀后过滤，在400 nm处测吸光度[18]。空白对照为不接种的培养液。每个样品测3次。
