菌种生产技术规程

食用菌菌种生产技术规程 DB13/T586—2004

1 范围 本标准规定了各种食用菌菌种生产的场地、厂房设置和布局、设备设施、使用品种、生产工艺流程、技术要求和包装贮运要求。本标准适用于各种食用菌固体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB191 包装储运图示标志（MODI）GB5749 生活饮用水卫生标准GB9687 食品包装用聚乙烯成型品卫生标准GB9688 食品包装用聚丙烯成型品卫生标准GB/T12728 食用菌术语NY5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义以及GB/T12728 中规定的其它术语适用于本标准。 3.1 品种 经分离、诱变、杂交或细胞融合而选育出来的生产上具有特异性、均一性和稳定性的食用菌菌株或成品系。 3.2 菌种 菌种是指经人工培养并可供进一步有性繁殖或栽培使用的食用菌的菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料，包括一级菌种、二级菌种和三级菌种。 3.3 一级菌种 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管为培养容器和使用单位，也称母种或试管种。 3.4 二级菌种 由一级菌种转接、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，常以透明的玻璃瓶或塑料瓶为容器，也称原种。 3.5 三级菌种 由二级菌种转接、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，直接应用于生产，常以透明的玻璃瓶、塑料瓶或塑料袋为容器，也称栽培种。 3.6 固体培养基 加入凝固剂或固态物质制成的培养基，有较稳定的形态。固体培养基包括琼脂培养基，以草料、麦粒、棉子壳、木屑、甘蔗渣等固形物质配制的培养基以及种木培养基。 3.7 种性 由本种食用菌遗传基因所决定而在菌丝性状、生长规律和形态特征等方面的一切表达。食用菌的品种特性，是鉴别食用菌菌种或品种优劣的重要标准之一。一般包括对环境条件的要求以及抗逆性、丰产性、出菇迟早、出菇潮数、栽培周期、商品质量、栽培习性等农艺性状。 3.8 折径 塑料袋（筒）压扁后的宽度，等于周长的1/2。 4 基本条件 4.1 技术人员 菌种厂应有与菌种生产所需相应的专业技术人员。 4.2 场地选择 4.2.1 基本要求 地势高燥，通风良好，水电齐备，交通便利。 4.2.2 环境卫生要求 至少300米之内无禽畜舍，无垃圾场，无污水和其它污染源。 4.3 菌种厂的规划与布局 4.3.1 厂房设置 有各自隔离的晒场、原材料库、配料分装室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室、贮存室、菌种检验室等。按照菌种厂的生产规模规划厂房各部分的面积大小，选择不同规格型号的设备及其台数。规划时注意各环节的设施规模要配套。 4.3.1.1 晒场 要求地势平坦干燥、通风良好、光照充足、空旷宽阔并远离火源。 4.3.1.2 原材料库 要求干燥、通风良好、防雨并远离火源。4.3.1.3 配料分装室 要求水电方便、空间充足。如安排在室外，应有天棚，防雨防晒。4.3.1.4 灭菌室 要求水电安全方便、通风良好、空间充足、散热畅通。4.3.1.5 冷却室 洁净、防尘、易散热，要有降温设备。 4.3.1.6 接种室 要设缓冲间，防尘、换气、密封性能良好；内壁和屋顶光滑，经常清洗消毒；要有调温设备。 4.3.1.7 培养室和贮存室 内壁和屋顶光滑，便于清洗消毒；要有调温设备。 4.3.1.8 菌种检验室 水电方便，利于装备相应的检验设备和仪器。 4.3.2 厂房布局 应按菌种生产工艺流程科学合理的安排布局，严防杂菌和虫害传播，并有利于流水作业，以提高工作效率。尤其注意原料仓库和晒场要尽量远离冷却室、接种室和培养室。 4.4 基本设备和常规用品 4.4.1 基本设备 搅拌机、装瓶装袋两用机、高压蒸汽灭菌锅或常压灭菌灶、超净工作台或接种箱、电热恒温培养箱或培养架以及冰箱等。 4.4.2 常规用具 酒精灯、药物天平、地秤、镊子、接种钩和接种铲、试管、菌种瓶和菌种袋、漏斗、电炉或煤炉、温湿度计、量筒和量杯、磨口瓶、水桶、盆、铝锅、塑料绳、牛皮纸或报纸以及精密PH试纸等。一级菌种厂还必须有分离培养、提纯复壮、菌种保藏及质量检测等仪器设备。 4.4.3 消毒药品 75%酒精、36%~40%甲醛、高锰酸钾、气雾消毒剂、5%石碳酸、1%~2%来苏尔、2%~5%漂白粉、硫磺等。 4.5 商用品种 应选用经我省审定或认定的优良品种，并应从具相应技术资质的供种单位引种。 5 工艺流程 培养基配制→分装→灭菌→冷却→接种→培养（检查）→成品，工艺流程见图1。但是普通菌种厂或生产单位应从具相应技术资质的供种单位引种，并从一级菌种的扩大培养做起，因此本标准主要规范“一级菌种扩大培养”及以下各步骤的生产技术。引进、分离或选育的纯菌种↓一级菌种培养基配制 → 高压灭菌 → 接种 → 培养与检查 → 小试 → 筛选 → 中试 ↓一级菌种培养基配制 → 高压灭菌 → 转接扩大 ← 出发菌株 ← 筛选 ↓ ↓ 培养与检查 保藏 ↓ 一级菌种 ↓接种↓二级菌种培养基配制 → 高压或常压灭菌 → 培养与检查 ↓ 二级菌种 ↓ 三级菌种培养基配制 → 高压或常压灭菌 → 接种 → 培养与检查 → 三级菌种图1 菌种选育及生产的工艺流程 6 生产过程中的技术要求6.1 培养容器 6.1.1 一级菌种使用玻璃试管和棉塞，试管18mm×180 mm 或20 mm×200 mm ，棉塞应使用普通棉花。 6.1.2 二级菌种使用750ml耐126℃高温、无色、淡绿色或淡蓝色透明的玻璃菌种瓶，或850ml耐126℃高温白色透明、符合GB9687要求的塑料菌种瓶。各类容器都应使用棉塞，棉塞应符合6.1.1规定；也可用能满足滤菌和透气要求的无棉塑料盖代替棉塞。如果用罐头瓶作菌种瓶，可用两层报纸和一层聚丙烯膜封口。 6.1.3 三级菌种使用符合6.1.2规定的容器，也可使用折径12cm~17cm、符合GB9687和GB9688要求的聚丙烯塑料袋或低压聚乙烯塑料袋。 6.2 培养基原料 6.2.1 化学试剂类要使用工业纯或以上级别试剂，如硫酸镁、磷酸二氢钾等。 6.2.2 生物制剂和天然材料类要求所选用原料无虫、无霉变，生物制剂可选用琼脂、酵母粉和蛋白胨等，天然材料可选用马铃薯、木屑、棉籽壳、麸皮等。 6.3 培养基配方 6.3.1 一级菌种培养基通常采用半合成琼脂培养基，不同种类的食用菌应采用不同的原料和碳氮比。常用配方见表1。表1 常用一级菌种培养基配方 （g/1000ml）配方 马铃薯 棉籽皮 木屑 干马粪 酵母浸膏 麸皮 葡萄糖 琼脂 蛋白胨 磷酸二氢钾 硫酸镁 维生素B11 200 20 20 2 200 20 20 3 1.5 0.013 100 100 50 20 20 2~10 3 1.5 0.014 100 100 50 20 20 5 3 1.5 0.015 150 50 20 6 2 20 20 10 1 0.5 注：大部分为通用培养基配方，配方5为粪草土腐生菌专用。 6.3.2 二级菌种和三级菌种培养基二级菌种和三级菌种培养基通常采用天然营养物质，应根据当地原料资源和所生产品种对营养的要求，选用适宜的配方。常用的二级菌种和三级菌种培养基配方见表2。表2 常用的二级菌种和三级菌种培养基配方配方 麦粒a 棉籽皮 木屑 玉米芯 发酵干粪草 麦秸 麸皮 蔗糖 石膏1 98 22 65 33 23 78~88 10~20 1 14 53~68 20~30 10~5 1 15 78~83 15~20 1 16 53~68 20~30 10~15 1 17 63 15 20 1 18 90 8 29 44 40 15 1注：配方1、2、8适用于蘑菇属的种类；配方9及以棉籽皮为主料的培养基适用于草菇；除了配方8以外，均适用于多数木腐菌。a:配方1和2中的麦粒预处理：先将麦粒用冷水浸泡12h后水煮，开锅后文火再煮20min左右，使麦粒充分煮透，胀而不破，切开后无白心，用水冷却后沥水摊开，晾干表面水分，将石膏拌入麦粒即可分装。 6.4 培养基的配制 6.4.1 一级菌种培养基的配制按配方要求称取各种营养物质；将去皮、去芽眼的马铃薯切片（加上棉籽皮、麸皮等），加水，文火煮沸30min，过滤取滤液；补足水量，加入琼脂，文火加热使之溶化；加入其它营养物质，调至适宜的酸碱度；趁热分装试管，分装量掌握在试管长度的1/4至1/5；塞好棉塞，3支或5支一捆，用两层报纸或一层牛皮纸包好灭菌；灭菌后摆放成的斜面顶端距试管口不少于50mm。 6.4.2 二级菌种和三级菌种培养基的配制按配方要求称取各种营养物质，先干拌，后湿拌，注意各种可溶性配料要先溶于水，再拌入料中，料要拌匀，含水量适宜，料水比一般为1：1.1~1.3；然后分装，装料要松紧适度，上下均匀一致，四周无空隙；一般装至瓶肩为宜，若用塑料袋，应装至距袋口不少于60mm；装好后，用直径为1.5cm~2cm的锥形木棒在料中央打孔至底部，然后封口。 6.5 灭菌一级菌种培养基配制分装后应立即灭菌；二级菌种和三级菌种培养基配制后应在4h内进锅灭菌，装置不宜过大。一级种培养基应在0.12Mpa，121℃下灭菌30min~40min，二级种和三级种培养基应在0.14Mpa~0.15Mpa，126℃下灭菌1.5~2.0h。灭菌完毕后，自然降温降压。常压灭菌应彻底排净冷空气，持续保持100℃（料温）10~13h，灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。 6.6 灭菌效果的检查随机取一定数量灭过菌的培养基，一级菌种培养基置28℃下恒温培养3d；二级菌种和三级菌种置28℃下恒温培养7d ，检查培养基的灭菌效果。 6.7 冷却冷却室使用前要进行消毒，通风后将灭过菌的二级菌种或三级菌种培养基放入，冷却至料温适宜。 6.8 接种 6.8.1 接种室或接种箱的使用清洁→放入接种物和被接种物→接种室（箱）的消毒处理→接种→接种室（箱）的后处理。 6.8.2 接种室（箱）的消毒方法用药物熏蒸、药液喷雾或用紫外灯照射。三者并用，效果更好。 6.8.3 超净工作台的消毒方法先用75%酒精溶液进行表面擦拭消毒，然后预净20min~30min 。 6.8.4 接种操作在接种室（箱）或超净工作台上严格按无菌操作接种。接完种后及时贴好标签，注明品种名称及接种日期等。 6.8.4.1 一级菌种的扩大一级菌种的接种通常在接种箱或超净工作台上进行，场地消毒后，首先用75%的酒精棉球将双手表面消毒，然后将一级菌种试管的外壁表面消毒，接种钩和接种铲表面消毒后火焰灭菌，冷凉再用。在灯焰附近用接种钩将培养基斜面横切成若干份（约3 mm宽），然后用接种铲将横切的培养基斜面每一份分成2~3小块，取一块（要带2 mm厚的培养基）放入新的试管培养基上塞好棉塞。一般每支试管斜面可转接扩大20~50支继代一级菌种。 6.8.4.2 二级菌种和三级菌种的接种通常在接种箱或接种室内进行。接种的要求与一级菌种基本相同。a)二级菌种的接种：将一级菌种试管表面消毒后带入接种箱，在酒精灯火焰上方，用接种钩将试管斜面分成4~6份，取一份迅速放入原种瓶内的洞口处，封好瓶口。b)三级菌种的接种：是把二级菌种转接到相同或相似的培养基上进行扩大培养。接种时，按无菌操作，用大镊子把二级菌种扒成1 cm ~2 cm 的小块，接于三级菌种培养基上3~4块；如果用菌种瓶作容器，可用大镊子或接种匙取3 cm 左右一块放于瓶内洞口处，然后封口。一般每瓶二级菌种可扩接三级菌种15~30袋或50瓶左右。 6.8.5 接种室（箱）的后处理接种室（箱）每次使用后，要及时清理，排除废气，清除废弃物，台面要用75%酒精溶液擦拭消毒。 6.9 培养室处理在使用培养室的前两天，采用药物消毒，通风换气后再用。 6.10 培养条件根据培养品种的不同生长要求，给予适宜的培养温度，保持空气相对湿度在60%左右，通风，避光。 6.11 培养期的检查各级菌种培养期间应定期检查，及时拣出污染或生长不良的不合格菌种。尤其应注意菌种萌发情况、菌丝生长态势等是否符合其种源特性，对于生长级慢、菌丝不匀的个别菌种要剔除，对于一批菌种均生长不良的，不能用于生产。 6.12 入库完成培养的菌种要及时登记入库。 6.13 记录生产各环节应详细记录。 6.14 留样各级菌种都应留样备查，留样的数量应以每个批号一级菌种3~5支，二级菌种和三级菌种5~7瓶（袋），于4℃~6℃（草菇在12℃~13℃）下贮存，贮存至使用者在正常生产条件下该批菌种出第一潮菇。 7 标志、包装及贮运 7.1 标志出售的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期等。 7.2 包装 7.2.1 一级菌种外包装采用木盒或有足够强度的纸材制作的纸箱，内部用棉花、碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。 7.2.2 二级菌种和三级菌种外包装采用有足够强度的纸材制作的纸箱，内部用碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。纸箱上部和底部用8 cm 宽的胶带封口，并用打包带捆扎两道，箱内附产品合格证书和使用说明。 7.2.3 包装箱外，除了应有7.1规定的标志外，还应有按照GB191规定应注明的图示标志：小心轻放标志、防水防潮防冻标志、防晒防高温标志、防止倒置标志以及防止重压标志。 7.3 贮存 7.3.1 一级菌种一般在2℃~4℃左右的冰箱中贮存，保藏期不超过9 d。草菇应在12℃~13℃下保存。 7.3.2 二级菌种应尽快使用，10 d内可在温度24℃左右、清洁、通风、干燥（空气相对湿度60%左右）、避光的室内存放。在5℃条件下贮存，草菇应在12℃~13℃贮存，保藏期不超过40 d。 7.3.3 三级菌种应尽快使用，在温度24℃左右、清洁、通风、干燥（空气相对湿度60%左右）、避光的室内存放时，麦粒不超过10 d，其余培养基的三级菌种不超过20 d。在5℃下（草菇应在12℃~13℃贮存）可贮存90 d。 7.4 运输各级菌种不得与有毒物品混装。气温达30℃以上时，需用2℃~20℃的冷藏车运输。运输中须有防震、防晒、防潮、防冻以及防杂菌污染的措施。