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1.1 菌种来源
2015年采自喜马拉雅山脉中段南坡, 珠穆朗玛峰东南侧 (属于西藏自治区日喀则市定结县陈塘镇) 阔叶森林的野生子实体。标本 (采集号ZRL20152036) 保存于中国科学院菌物标本馆 (馆藏号HMAS279131) 。
1.2 标本分离与鉴定
1.2.1 菌种分离:
采用组织分离法在PDA培养基上获得菌丝体, 菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (保藏号CGMCC13698) 。
1.2.2 标本鉴定:
形态学鉴定:对新鲜标本用解剖刀纵切子实体观察其菇盖组成、菌肉的颜色、质地、菌褶形状和着生情况、菌柄的组成、菌柄的质地、中实或中空等宏观形态特征。充分干燥后, 置于塑料封口袋中保存并带回实验室, 进行微观形态观察。首先用尖头镊取一块2–3mm的菌褶放在清洁的载玻片中央, 滴半滴95%的酒精软化, 标本回软后加一滴10%刚果红染色剂, 1min后用吸水纸将染色剂吸干;再加入5%氢氧化钾水溶液作为悬浮剂, 制成镜检材料;加盖盖玻片, 在光学显微镜下观察其微观特征, 包括担子和担孢子形状、大小、颜色、囊状体有无等特征。
1.2.3 分子系统发育分析:
DNA提取:将野外采的集标本ZRL20152036、分离的菌株、人工栽培的子实体 (馆藏号HMAS255159) 采用CTAB法提取DNA。
ITS扩增:参照黄晨阳等 (2015) 和罗韵等 (2016) 的方法, 利用ITS4 (5′‐TCCTCCGCTTATTGATA GC‐3′) 和ITS5 (5′‐GGTGAGAGATTTCTGTGC‐3′) 引物对ITS1‐5.8S‐ITS2 r DNA进行PCR扩增。PCR反应体系:2μL DNA模板、1μL ITS4 (10pmol/μL) 、1μL ITS5 (10pmol/μL) 、12.5μL 2×Taq PCR Master Mix (200mol/L d NTPs、4.0mmol/L Mg Cl2、2.5U Taq DNA聚合酶) 、dd H2O补齐至25μL。扩增程序为94℃预变性4min, 然后94℃变性40s、50℃退火50s、72℃延伸50s, 35个循环, 最后一个循环72℃延伸8min, PCR扩增产物由北京博迈德测序公司进行测序。
获得的自测序列和从Gen Bank下载的相关序列构成分析数据库 (表1) , 首先使用MAFFT软件 (Katoh&Standley 2013) 进行序列自动比对, 然后进行手动调整, 整理好的序列保存为.nex格式 (Hall et al.1999) , 用Mr MTGui软件结合Paup软件和Mr Modeltest软件检验获得最佳替换模型为GTR+I+G, 使用Mr Bayes软件构建系统发育树 (Larget&Simon 1999;Ronquist et al.2012) , 以4条马尔科夫链以随机树开始, 使用蒙特卡洛算法, 运算1 000 000代, 每100代取样一次, 当分裂频率标准差 (average standard deviation of split frequencies) 降低至0.01以下时确认运算达到稳态而结束运算, 如分裂频率标准差大于0.01则继续运算1 000 000代, 计算后验概率 (posterior probabilities) 时去掉前25%的树, 分枝的后验概率>95%时为显著支持的分枝。
1.3 人工驯化试验
1.3.1 培养基和栽培料的配制:
综合PDA培养基:马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B1 10mg、琼脂25g, 水1L。原种培养基:麦粒85%、棉籽壳10%、磷酸二氢钾3%、石膏粉1.5%、碳酸钙0.5%, 121℃下高压灭菌2h, 500g/瓶。栽培料:棉籽壳43%、玉米芯43%、麦麸12%、石灰2%、p H自然, 121℃下高压灭菌2h, 2kg/袋。
1.3.2 人工驯化试验:
将野外分离保存的菌丝体在综合PDA培养基上纯化。挑取纯化后的菌落尖端部分菌丝于综合PDA培养基上, 在25℃恒温培养箱中避光培养。待菌丝长满培养皿后切取3cm×3cm的菌丝块接种在装有原种培养基的原种瓶中, 24–25℃避光培养。原种菌丝长满后转接到22cm×45cm×2.5cm的栽培料中, 在白天温度为22℃、夜晚温度18℃的人工气候室中发菌。待菌丝长满栽培料后, 通过加大昼夜温差刺激, 促进形成原基, 然后加大通风和相对湿度等出菇管理, 出菇后进行采摘。期间记录各生长阶段的温度、湿度、菌丝生长情况、现蕾时间、出菇时间;出菇后记录菇体农艺特征, 如菌盖大小、颜色、菌柄长短、重量等。
1.4 商品价值评价
1.4.1 毒性及风味:
将人工栽培的卵孢侧耳鲜品和加热煮熟后的子实体分别喂食猫、狗、小白鼠等动物, 确认无毒后进行口感及风味的调研, 从子实体的外观、鲜菇味道、口感、烹饪方式等方面做出评价。
1.4.2营养成分分析:
对人工栽培卵孢侧耳子实体烘干后进行营养成分分析, 氨基酸含量测定采用日立L 8900型氨基酸自动分析仪, 参照GB5009.124‐2016《食品中氨基酸的测定》, 多糖含量测定采用硫酸苯酚法, 参照NY/T 1676‐2008《食用菌中粗多糖含量的测定》, 蛋白质含量测定采用凯氏定氮法, 参照GB5009.5‐2016《食品中蛋白质的测定》, 灰分含量测定参照GB5009.4‐2016《食品中灰分的测定》, 膳食纤维含量测定参照GB5009.88‐2014《食品中膳食纤维的测定》, 矿物质含量测定参照GB5009.268‐2016《食品中多元素的测定》, 粗纤维含量测定参照GB/T5009.10‐2003《植物类食品中粗纤维的测定》, 脂肪含量测定参照GB5009.6‐2016《食品中脂肪的测定》, 能量和碳水化合物测定参照GB/Z 21922‐2008《食品营养成分基本术语》。卵孢侧耳的各项营养成分和已发表的主要栽培种类营养成分进行对比分析, 如:香菇Lentinula edodes (Berk.) Pegler、金针菇Flammulina velutipes (Curtis) Singer、刺芹侧耳Pleurotus eryngii (DC.) Quél.、柱状田头菇 (茶树菇) Cyclocybe aegerita (V.Brig.) Vizzini、双孢蘑菇Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach. (张璐等2017) 。
1.4.3 重金属含量分析:
对人工栽培卵孢侧耳子实体的重金属含量进行检测, 铅含量测定参照GB5009.12‐2017《食品安全国家标准∙食品中铅的测定》;镉含量测定参照GB 5009.15‐2014《食品安全国家标准∙食品中镉的测定》;汞含量测定参照GB5009.17‐2014《食品安全国家标准∙食品中汞的测定》;砷含量测定参照GB 5009.11‐2014《食品安全国家标准∙食品中砷的测定》。