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1. 羊肚菌菌种分离 新鲜羊肚菌子实体用自来水冲洗, 再用无菌水冲洗两遍, 置于灭菌滤纸上吸干水分。用无菌解剖刀取菌柄与菌帽交接处的内部组织, 无菌操作转移到PDA培养基平皿, 于25℃培养, 纯化的菌株转入试管斜面培养, 待菌丝布满斜面后转入冰箱4℃低温保存。分别以采集地命名羊肚菌菌株 (百花岭, BHL;贡山, GS;芒宽, MK;潞江坝坝弯, BW) 。
2. DNA提取、ITS扩增及测序
2.1 菌株总DNA的提取 羊肚菌菌株在PDA培养基上培养3周, 刮取菌丝, 采用北京百泰克生物技术有限公司的“真菌基因组DNA提取试剂盒” (DP2032) 提取基因组DNA, 用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 于-20℃冰箱中保存备用。
2. 2 ITS序列扩增及测序 ITS序列的扩增用引物ITS1和ITS4, 由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。反应体系 (50μL) :10×Buffer (含2 mmol/L Mg2+) 5μL、2.5 mmol/L d NTP 4μL、10μmol/L正向和反向引物各2μL、5 U Taq酶0.5μL、模板1μL、灭菌水33μL。扩增程序:95℃4 min;94℃45 s, 56℃45 s和72℃50 s, 循环8次, 每循环退火温度降低0.5℃;94℃45 s, 52℃45 s和72℃50 s, 循环25次;72℃10 min, 12℃保存。扩增产物用1%琼脂糖胶检测DNA, 选取清晰无杂质的条带切胶纯化, 纯化后的样品送往北京诺赛基因组研究中心直接测序。对部分测序拖带、杂合和非特异等测序结果, 将样品进行克隆测序。
3. 测序数据处理及分析 利用Bioedit检测ABI文件中峰图的优劣, 选取无双峰、无杂合等序列, 克隆测序时去除载体, 正反向测序时使用Seq Man进行序列拼接。在Gen Bank数据库中下载已知羊肚菌的ITS序列, 使用Clustal X 2.1进行序列比对, ML运算使用MEGA 6软件进行。
